Sabouraud agarfundament, tilberedning og bruk

1692
Jonah Lester

De Sabouraud agar, også kjent som Sabouraud dextrose agar, det er et solid kulturmedium, spesielt beriket for isolering og utvikling av sopp, som gjær, mugg og dermatofytter..

Derfor kan dette mediet ikke mangle i et mikrobiologilaboratorium for å undersøke tilstedeværelsen av patogene eller opportunistiske sopp, verken fra kliniske eller ikke-kliniske prøver. På samme måte er det også ideelt for vekst av filamentøse bakterier som Streptomyces og Nocardias. Bruken er veldig bred, da den kan brukes i menneskelig, dyr, plante og industriell mykologi.

A. Ubrukt Sabouraud-agar. B. Sabouraud agar sådd med gjær. Kilde: Bilder tatt av forfatteren MSc. Marielsa gil

Dette mediet ble opprettet i 1896 av den fremtredende hudlege Raimond Sabouraud, som ble en verdenskjent spesialist i lidelser i hodebunnen, hovedsakelig forårsaket av dermatofytter..

Opprettelsen var så viktig at den har blitt brukt siden den gang og forblir i dag, men med noen modifikasjoner.

Selv om det er spesielt for sopp, kan bakterier vokse i dette mediet. Derfor, for prøver med blandet flora, er det nødvendig å inkludere antibiotika i preparatet, og dermed hemme veksten av bakteriefloraen som kan være til stede..

Valget av antibiotika må gjøres nøye og med tanke på typen sopp som skal utvinnes, siden noen hemmes i nærvær av visse stoffer..

Artikkelindeks

  • 1 Begrunnelse
    • 1.1 Mest brukte kombinasjoner av Sabouraud dextrose agar med antibiotika
  • 2 Klargjøring
    • 2.1 Sabouraud dekstrose agar 
    • 2.2 Sabouraud dextrose agar (Emmons modifikasjon)
    • 2.3 Sabouraud dextrose agar (Emmons modification) med kloramfenikol
    • 2.4 Sabouraud Emmons Dextrose Agar med Cycloheximide
    • 2.5 Sabouraud dekstrose-agar (Emmons) med kloramfenikol og cykloheksimid
    • 2.6 Andre antibiotika som kan tilsettes
  • 3 Spesielle hensyn
  • 4 Kvalitetskontroll
  • 5 bruksområder
    • 5.1 Primærkultur
    • 5.2 Sporulasjon
    • 5.3 Bevaring
    • 5.4 Mikrokulturer
    • 5.5 I menneskelig mykologi
    • 5.6 Dyrmykologi
    • 5.7 Miljømykologi
    • 5.8 Industriell mykologi
    • 5.9 Plantemykologi
  • 6 Referanser

Basis

Sabouraud dextrose agar er et medium som i sin opprinnelige formulering er svakt selektivt, på grunn av sin sure pH på 5,6 ± 0,2, men bakterier kan fortsatt utvikle seg, hovedsakelig i langvarige inkubasjoner.

Mediet inneholder kaseinpepton og fordøyelse av dyrevev i bukspyttkjertelen, som gir kilden til karbon og nitrogen for vekst av mikroorganismer..

Den inneholder også en høy konsentrasjon av glukose, som fungerer som en energikilde, og fremmer vekst av sopp over bakterier. Alt blandet med agar-agar, en komponent som gir den riktig konsistens..

På den annen side kan Sabouraud dextrose-agar være selektiv hvis antibiotika tilsettes..

Med antibiotika er det spesielt nyttig i sårprøver, åpne sår eller andre prøver der det er mistanke om stor bakteriell forurensning..

Mest brukte kombinasjoner av Sabouraud dextrose agar med antibiotika

-Sabouraud-agar med kloramfenikol: ideell for utvinning av gjær og filamentøse sopp.

-Sabouraud agar med gentamicin og kloramfenikol: nesten alle filamentøse sopp og gjær vokser på dette mediet og hemmer et stort antall bakterier, inkludert Enterobacteriaceae, Pseudomonas og Staphylococcus.

-Sabouraud agar med cykloheksimid: det er spesielt nyttig for prøver fra huden eller luftveiene, så lenge mistanken er dimorfe sopp.

Sykloheksimid bør brukes med forsiktighet; Selv om det brukes til å hemme veksten av ikke-patogene eller miljømessige sopper og gjær som kan være til stede som forurensninger i en prøve, hemmer det også veksten av noen sopper som f.eks. Cryptococcus neoformansAspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp og andre opportunistiske sopp.

-Sabouraud agar med kloramfenikol pluss cykloheksimid: brukes primært til å isolere dermatofytter og dimorfe sopp. Det har ulempen at det hemmer noen arter av opportunistiske sopp som Candida ingen albicans, Aspergillus, Zygomycetes eller C. neoformans.

-Sabouraud-agar med kloramfenikol, streptomycin, penicillin G og cykloheksimid: den er ideell for prøver som er ekstremt forurenset med bakterier og saprofytiske sopp, men den har ulempen at den hemmer veksten av Actinomyces og Nocardias, i tillegg til de opportunistiske soppene nevnt ovenfor.

Forberedelse

Hvis du har ingrediensene hver for seg, kan de tilberedes som følger:

Sabouraud dekstrose agar 

Veie:

- 40 gr dekstrose

- 10 g pepton

- 15 gr agar-agar

- Mål 1000 ml destillert vann

Alle ingrediensene blandes, pH justeres til 5,6. Oppløste stoffer oppløses ved koking, 20 ml av mediet fordeles i rør på 25 x 150 mm, uten kant og helst med en bomullshette..

Rør med bomullshett. Kilde: Foto tatt av forfatteren MSc. Marielsa gil

Andre rørstørrelser kan også brukes, avhengig av tilgjengelighet.

De autoklaveres i 10 minutter ved en trykkatmosfære (121 ° C). Autoklaveringstiden bør ikke overskrides. Når du forlater autoklaven, er rørene tilbøyelige ved hjelp av en støtte til de stivner i en fløyttopp..

En annen måte er å oppløse ingrediensene ved oppvarming til kokepunktet. I samme kolbe, autoklav i 10 minutter og fordel deretter 20 ml i petriskåler..

Hvis du har et Sabouraud dextrose-agarmedium som allerede inneholder alle ingrediensene, må du veie mengden som er spesifisert av det kommersielle selskapet for en liter vann. Resten av trinnene er de samme som de som er beskrevet ovenfor.

Sabouraud dekstrose agar (Emmons modifikasjon)

Veie:

-  20 gr dekstrose

- 10 g pepton

-  17 gr agar-agar

-  Mål 1000 ml destillert vann

Alle ingrediensene blandes, pH justeres til 6,9. Fortsett på samme måte som den forrige saken.

Det er kommersielle hus som tilbyr mediet med alle ingrediensene. I dette tilfellet må du veie og forberede som beskrevet på innsatsen..

Sabouraud dextrose agar (Emmons modification) med kloramfenikol

Kloramfenikol lagerløsning

- Vei 500 mg kloramfenikolbase

- Mål 100 ml 95% etanol

- Blande

Sabouraud dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som beskrevet tidligere og tilsett i tillegg for hver liter medium 10 ml kloramfenikolstamoppløsning før autoklavering..

Sabouraud Emmons Dextrose Agar with Cycloheximide

Cycloheximide lagerløsning

- Vei 5 g cykloheksimid

- Mål 100 ml aceton

- Blande

Sabouraud dextrose-agarmedium (Emmons) fremstilles som tidligere beskrevet, og tilsett i tillegg for hver liter medium 10 ml cykloheksimid-stamløsning før autoklavering..

Sabouraud dextrose agar (Emmons) med kloramfenikol og cykloheksimid

Sabouraud dextrose-agarmedium (Emmons) tilberedes som allerede beskrevet, og tilsett i tillegg for hver liter medium 10 ml kloramfenikolstamoppløsning og 10 ml cykloheksimidstamoppløsning før autoklavering..

Andre antibiotika som kan tilsettes

20.000 til 60.000 enheter penicillin per liter medium.

30 mg streptomycin per liter medium.

Begge må innarbeides etter at mediet har blitt autoklavert, litt avkjølt (50-55 ° C).

0,04 g neomycin per liter medium.

0,04 g gentamicin per liter medium.

Spesielle hensyn

For sikkerhets skyld foretrekkes det å så Sabouraud dextrose-agar i kileformede rør (tilbøyelig i fløytenebb) i stedet for i petriskåler, for å unngå spredning og innånding av sporer.

Det er viktig at Sabouraud-agarrør er dekket av bomull og ikke med en skruehett, ettersom semi-anaerobe forhold har vist seg å hemme spordannelse i noen stammer, for eksempel Coccidioides immitis. Også de fleste sopp er aerobe..

Hvis du bruker skruelokk, må du ikke lukke hermetisk.

QA

Forberedte medier bør gjennomgå kvalitetskontroll for å verifisere at de fungerer. For dette sås visse kontrollstammer.

For Sabouraud dextrose agar med kloramfenikol, ATCC stammer av Candida albicans, som må ha utmerket vekst. En annen plate er inokulert med stammer Escherichia coli, må være fullstendig hemmet.

En uinokulert plate inkuberes også der ingen mikroorganismer skal vokse..

For Sabouraud dekstrose agar med kloramfenikol og cykloheksimid, stammer av  Trichophyton mentagrophytes, skal utvikle seg godt. En annen plate inokuleres med en stamme av Aspergillus flavus, der det må være liten eller ingen vekst. I tillegg inkuberes en uinokulert plate for å demonstrere dens sterilitet..

For Sabouraud dekstrose agar med cykloheksimid, stammer av Candida albicans, Trichophyton rubrum  eller Microsporum canis, som må vise god vekst.

Likeledes en stamme av Aspergillus flavus, viser liten eller ingen vekst. Til slutt ruker du en uinokulert plate for sterilitetskontroll..

applikasjoner

Primærkultur

Klassisk Sabouraud dextrose-agar inneholder 4 gram dekstrose og er utmerket som et primært isolasjonsmedium, da det viser den karakteristiske morfologien til hver sopp..

Det er også utmerket for å demonstrere pigmentproduksjon. Det er imidlertid ikke det mest egnede middel for å observere sporulering..

Det anbefales heller ikke til dyrking Blastomyces dermatitidis, som inhiberes av den høye konsentrasjonen av glukose som er tilstede.

På den annen side må det tas hensyn til visse hensyn for dyrking.

Noen sopper vokser best ved romtemperatur, som muggsopp, andre vokser vellykket ved 37 ° C, som noen gjær, og andre kan vokse ved begge temperaturer (dimorfe sopp).

Av denne grunn er det noen ganger nødvendig å bruke flere Sabouraud-agarplater for samme prøve, siden duplikatsåing ofte utføres for å inkubere en plate ved romtemperatur og en annen ved 37 ° C..

For eksempel, Sporothrix schenckii den blir sådd i to plater; den ene inkuberes ved romtemperatur for å oppnå formfasen og den andre inkuberes ved 37 ° C for å oppnå gjærfasen, men i sistnevnte er det nødvendig å tilsette 5% blod til mediet.

I andre tilfeller, for eksempel mycetomprøver, frøes det to Sabouraud-agarplater, en med kloramfenikol og den andre med cykloheksimid. Den første vil tillate vekst av forårsakende midler av mycetoma av soppopprinnelse (Eumycetoma) og den andre forårsakende agenter for mycetoma av bakteriell opprinnelse, slik som actinomycetomas..

Sporulasjon

Sabouraud dextrose agar modifisert av Emmons inneholder 2 gram dekstrose og brukes ikke bare til isolasjon, men også til sporulering og konservering av sopp.

I dette mediet, hvis stammer av Blastomyces dermatitidis.

Bevaring

For å bevare soppkulturer, kan de oppbevares i kjøleskap (2-8 ° C). Bevaringstiden kan variere mellom 2 og 8 uker. Etter denne tiden må de underkultureres for å gjenta prosessen..

Noen sopper holder seg best ved romtemperatur, som f.eks Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum Y Microsporum audounii.

Vedlikehold av stammen kan forlenges for å unngå pleomorfisme hvis dekstrose elimineres fullstendig fra agaren og hvis mengden agar i mediet reduseres for å unngå tørrhet.

Mikrokulturer

For å identifisere noen filamentøse sopp er det nødvendig å utføre mikrokulturer ved bruk av Sabouraud-agar eller andre spesielle midler for å observere strukturer for seksuell og aseksuell reproduksjon..

I menneskelig mykologi

Det brukes hovedsakelig til diagnostisering av soppsykdommer, spesielt de som påvirker huden og dens fester (hår og negler).

Prøvene kan være sekreter, ekssudater, hud, hår, negler, sputum, CSF eller urin. Vanligvis isolerte patogener er dermatofytter, sopp som forårsaker subkutan og systemisk mykose..

Dyrmykologi

Dyr blir ofte påvirket av soppinfeksjoner, derfor er Sabouraud-agar like nyttig i dyre-mykologi som den er hos mennesker..

For eksempel kan dermatofytter ofte påvirke dyr. Slik er tilfellet med Microsporum canis var distortum, Det smitter ofte hunder, katter, hester, griser og aper. like måte, Microsporum gips smitter hunder, katter og husdyr.

Fugler som kyllinger, haner og kyllinger påvirkes av Microsporum gallinae.

Andre sopper, som Zymonema farciminosum, De er også årsaken til sykdom hos dyr, hovedsakelig hester, muldyr og esler, og forårsaker betydelig betennelse i lymfekarene..

Sporothrix schenkii og Histoplasma capsulatum påvirker husdyr og mennesker.

Miljømykologi

Mange patogene eller opportunistiske sopp kan konsentrere seg til enhver tid i et gitt miljø, spesielt i operasjonsrom og intensivavdelinger (klinikker og klinikker) på klinikker og sykehus. Derfor er det nødvendig å utføre en kontroll av dem.

Andre sårbare rom er biblioteker og gamle bygninger, som kan påvirkes av konsentrasjonen av miljøsopp.

I miljøstudier brukes Sabouraud dextrose agar til isolering av sopp..

Industriell mykologi

Sabouraud dextrose agar kan ikke være fraværende for studiet av forurensende sopp i produksjonen av kosmetikk, mat, drikke, lær, tekstiler, blant andre..

Plantemykologi

Planter lider også av sykdommer forårsaket av sopp, som påvirker forskjellige deler av planten, som til og med kan avslutte høsten, og forårsake store tap i jordbruket..

Referanser

  1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologisk diagnose av mykoser og soppfølsomhetsstudier. Anbefalinger fra det spanske samfunnet for smittsomme sykdommer og klinisk mikrobiologi. Tilgjengelig på: coesant-seimc.org
  2. ValteK laboratorium. (2009). Sabouraud dekstrose-agar med cykloheksimid. Tilgjengelig på: andinamedica.com.
  3. Navarro O. (2013). Veterinær mykologi. Nasjonalt agraruniversitet. Nicaragua.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12. utg. Argentina. Redaksjonell Panamericana S.A
  5. Casas-Rincón G. Generell mykologi. 1994. 2. utg. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.

Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.