Wrights begrundelse, materialer, teknikk og bruksområder

1761
Philip Kelley
Wrights begrundelse, materialer, teknikk og bruksområder

De Wright flekk er en fargeteknikk opprettet av den amerikanske patologen James Homer Wright i 1902, basert på Romanowsky-flekken. Siden Romanowsky-flekken var ustabil, inkorporerte Wright metanol som løsemiddel og fiksativ..

Denne fargen er polykromatisk, noe som betyr at den genererer flere farger, avhengig av strukturen som absorberer fargestoffet. Denne fargeteknikken har blitt brukt mye for å utføre differensialt antall hvite blodlegemer og for å studere morfologien til røde blodlegemer, blodplater og leukocytter i perifert blod og benmarg..

Ulike perifere blodutstryk beiset med Wrights flekk. A. Akutt leukemi B. Plasmodium vivax i erytrocyten. C. Plasmodium falciparum, macrogametocyte. D. Lymfocytt

Anvendelsen er veldig viktig, siden abnormiteter kan sees i de forskjellige cellelinjene i blodet, noe som letter diagnosen sykdommer som leukemi eller bakterielle eller parasittiske infeksjoner..

Kanskje dette er de vanligste bruksområdene der denne teknikken brukes, men de er ikke de eneste. Det er også nyttig i andre prøver enn blod og beinmarg, som blant annet neseutslipp, fekal slim, sputum, hudprøver..

Artikkelindeks

  • 1 Begrunnelse for Wrights flekk
  • 2 Materialer
    • 2.1 Klargjøring
    • 2.2 Bufferløsning
    • 2.3 Ekstra materialer som trengs for å utføre fargeleggingen
  • 3 komponenter av Wrights flekk
    • 3.1 Metanol
    • 3.2 Spjeld
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Metylenblått
  • 4 Teknikk
  • 5 Verktøy
    • 5.1 Hematologi
    • 5.2 Neseutslipp
    • 5.3 Parasitologi
    • 5.4 Luftveisinfeksjoner
    • 5.5 Bakteriologi
    • 5.6 Mykologi
  • 6 Hvordan observeres strukturene i blodprøven med Wright-flekken?
  • 7 Anbefalinger for god farging
  • 8 Vanlige feil i Wright-fargelegging
    • 8.1 Svært blek flekker
    • 8.2 Fargestoff utfelles
    • 8.3 Smører med ekstremt rødlig eller blå farge
  • 9 Lagringsmodus
  • 10 Referanser

Begrunnelse for Wrights flekk

Wright-flekken ble født fra Romanowsky-flekken, som består av en metylalkoholoppløsning av et surt fargestoff (eosin Y) og et basisk fargestoff (metylenblått) og deres oksidasjonsprodukter..

Blandingen av fargestoffer som brukes i Wrights flekk forårsaker effekten kjent som Romanowsky, det vil si at den gir en vakker lilla farge til kjerner av leukocytter og nøytrofile granuler, mens de røde blodcellene flekker rosa..

Komponentene som er ansvarlige for å gi det typiske fargespekteret til Wrights flekk, er blå B og eosin Y. Effekten som observeres vil avhenge av fargestoffets binding til kjemiske strukturer og interaksjonene mellom blå B og eosin Y.

Syrestrukturer som nukleinsyrer, kjerneproteiner og reaktivt umoden cytoplasma av noen celletyper, fikser blå B (grunnleggende flekk).

Mens grunnleggende strukturer som hemoglobin, binder granulatene av segmenterte eosinofiler, blant andre cellulære strukturer, eosin Y (surt fargestoff).

Fargingsresultatet kan påvirkes av forskjellige faktorer, slik som pH-verdien til Wright-fargestoffet, bufferen og vaskeoppløsningen; samt flekker og fikseringstid.

Derfor er hvert trinn i klargjøringen av reagensene avgjørende og må utføres med omsorg for alle detaljer..

Materialer

Wrights flekk. For 100 ml kreves det:

Vei ut 0,3 g Wrights flekk, mål 97 ml metanol og 3 ml glyserol.

Forberedelse

I en mørtel, legg den tunge mengden Wrights flekk og innfør glyserolen gradvis til pulveret er helt oppløst..

Deretter tilsettes metanolen, blandes og helles i en gul flaske.

Før bruk skal løsningen ristes med milde bevegelser og filtreres.

Bufret bufferløsning

I en liter destillert vann tilsettes 3,76 g dinatriumhydrofosfat (NatoHPO4   2Hto0) pluss 2,1 g dihydrogenkaliumfosfat (KHtoPO4).

Bland veldig godt til alle inkorporerte reagenser er oppløst. Juster pH til 7,2. Hell i en glasskrukke og oppbevar ved romtemperatur.

Ytterligere materialer som trengs for å utføre fargeleggingen

I tillegg kreves det andre materialer for å kunne utføre fargeteknikken, disse er: objektglass eller dekker gjenstander, fargebro, t-skjorter med vann eller buffer for vask, en stoppeklokke for å holde fargetidene og noe blottingmateriale. (absorberende papir, gasbind eller bomull).

Komponenter av Wrights flekk

Metanol

Alkohol (metanol) fungerer som et fiksativ for blodutstrykningen til lysbildet.

Det er i utgangspunktet et reduserende, dehydratiserende og koagulerende fiksasjonsreagens. Derfor er dens funksjon å koagulere proteiner og gjøre dem uoppløselige, men uten å denaturere dem..

Metanol er det mest brukte smørefikseringsreagenset i alle laboratorier, da det gir bedre resultater enn etanol. Den ideelle konsentrasjonen er 99%.

Spjeld

Bufferen (bufret løsning) har funksjonen til å justere eller opprettholde fargenes pH, siden en pH justert til 7,2 er viktig for at cellestrukturene skal kunne absorbere fargestoffene riktig..

På den annen side dehydrerer metanolfikseringstrinn cellene, og bufferen hjelper til med å rehydrere dem..

Eosin (Y)

Eosin har en affinitet for byggesteiner fordi det er et surt fargestoff. To typer eosin er kjent veldig likt hverandre, så mye at en av de to kan brukes, og oppnår samme resultat..

Den ene kalles eosin Y, gul eosin eller tetrabromofluorescein, og den andre kalles eosin B, blåaktig erytrosin B eller dibromodinitrofluorescein. Imidlertid er eosin Y den mest brukte.

Den viktigste egenskapen til dette fargestoffet er dens negative polaritet, dette gjør det tiltrukket av positivt ladede cellestrukturer.

Metylenblått

Det er grunnfargen. Hovedegenskapen er metakromasi, det vil si at ikke alle strukturer farges i samme farge, det avhenger av den kjemiske sammensetningen av strukturene som blir farget..

Noen blir lys eller mørkeblå, og noen blir mørk lilla eller blek syrin.

Teknikk

1 - Utfør spredning av prøven slik at en tynn film blir igjen, enten på et lysbilde eller dekkglass.

2-La det tørke i luften i omtrent 2 timer.

3 Plasser den tørre utstrykingen på fargebroen eller flekkbrettet med spredningen av prøven opp..

4-Dekk til arket med Wright-flekken dråpe for dråpe til hele overflaten er dekket. La virke i 5 - 8 minutter.

5-Flekken skal dekke lysbildet helt, uten å søle over kantene. Hvis det begynner å fordampe i løpet av fargetiden, tilsett noen ekstra dråper.

6-Tilsett deretter en like stor mengde støtdemper, blås litt til den karakteristiske metallglansen vises. Tidspunkt 10 til 15 minutter.

7-Vask med vann fra springen, legg den milde strømmen til laken ser rosa ut.

8-Med en gasbind impregnert med alkohol, fjern fargestoffet som er festet på baksiden av lysbildet.

9-La smøret tørke veldig godt før du legger dyppoljen for å se den under mikroskopet.

Nytte

Hematologi

Det er ideelt for flekker av perifert blodutstryk, for undersøkelse av tykke blodutstryk og for studier av celler fra beinmargsprøver.

På grunn av de kjemiske egenskapene til denne kombinasjonen av fargestoffer, kan cellestrukturer lett gjenkjennes, og være i stand til å skille de forskjellige celletyper som er tilstede.

Rennende nese

Denne teknikken er veldig nyttig for å identifisere cellene i neseutslippene (epitelceller, segmenterte eosinofiler, polymorfonukleære celler) ved diagnosen allergisk rhinitt..

parasitologi

Slik sett har det vært nyttig for studiet av Leishmania sp i histiocyttene i det subkutane cellevevet i hudsår. På samme måte brukes den til å identifisere leukocytter i avføringsprøver (fekalt leukogram).

I dette tilfellet er det av interesse for legen å vite om leukocytosen som er tilstede i avføringen er polymorfonukleær eller mononukleær. Dette funnet i fekalt leukogram vil lede om det er henholdsvis en bakteriell eller en virusinfeksjon..

På den annen side kan parasitter som sirkulerer i blodet bli funnet i erytrocyten eller frie i plasmaet. De søkte parasittene er Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii og filariae, og innen veterinærmedisin er det nyttig i søket etter Theileria equi Babesia caballi, forårsakende agenser for bebesiose, spesielt hos hest.

Wright-flekken og også Giemsa-flekken gjør det mulig å skille hemoparasitter fra normale mobilkomponenter. To typer pålegg kan brukes til dette:

Spres fint

Blod spres som en tynn film på en lysbilde. Farget med Wrights flekk, og avslører kjennetegnene til kjernen og cytoplasmaet.

Tykt fall

Denne metoden brukes til å undersøke tilstedeværelsen av parasitter i en større mengde blod..

For å gjøre dette plasseres en stor dråpe blod på et lysbilde. Når du er der, må den defibrilleres og lage større og større sirkler fra midten og utover ved å bruke kanten av et annet lysbilde..

Til slutt, for å være i stand til å observere parasittene i det tykke utstryket, må erytrocyttene lyseres med vann..

Luftveisinfeksjoner

På respirasjonsnivå er denne teknikken også nyttig, fordi cellene som er tilstede i prøvene på sputum, bronkialskylling eller bronkoalveolar, er viktige for å fastslå diagnosen..

Tilsvarende kan polymorfonukleære celler og mononukleære celler skilles ut her..

Bakteriologi

Bruken av denne teknikken i bakteriologi er begrenset, fordi den ikke er bra for farging av bakterier, og det er derfor andre spesialiserte fargeteknikker brukes til farging av dem..

Imidlertid har det blitt brukt til å søke etter epitelceller med inklusjonslegemer av Chlamydia trachomatis i utstryk av urinrøret eller endocervikal slimhinne, selv om det må erkjennes at det ikke er den beste metoden for dette.

Det er også mulig å observere spirallignende bakterier som Borrelia burgdorferi hos infiserte pasienter, så vel som morulae eller inklusjonslegemer av Ehrlichia sp i cytoplasmaet til lymfocytter, monocytter eller nøytrofiler i blodutstryk.

Mykologi

De Histoplasma capsulatum er en patogen sopp som ofte diagnostiseres ved mikroskopisk observasjon av forskjellige vevsprøver, farget med Wrights flekk.

Hvordan observeres blodprøvestrukturene med Wright-flekken?

Kilde: Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health, Chile. Anbefalinger for farging av blodutstryk for å lese blodtellingen.

Anbefalinger for god farging

Utstryk av blodprøver skal lufttørke spontant. Flekker skal være så tynne som mulig for å oppnå bedre fiksering av fargestoffet og unngå overfarging..

For høykvalitets flekker anbefales det å flekker innen to timer etter klargjøring av smøre. På den annen side er den ideelle prøven kapillærblod uten antikoagulant.

Imidlertid, hvis det brukes venøst ​​blod, bør det brukes som et antikoagulerende EDTA og ikke heparin, siden sistnevnte kan deformere cellestrukturer..

For å unngå forringelse av det tilberedte fargestoffet, bør det lagres på tørre steder.

Under vaskeprosessen anbefales bruk av vann justert til en nøytral pH..

Til slutt anbefales det å teste fargemetodene som brukes i laboratoriet så ofte..

Dette gjøres ved farging av prøver eller utvidede mønstre, som en kvalitetskontroll. Dette trinnet er viktig, da det sørger for at farging er riktig forberedt og fargetidene er godt standardiserte..

Hvis mønsterarket er dårlig farget, er det problemer som må løses..

Vanlige feil i Wright-farging

Veldig blek flekker

Svært bleke flekker skyldes vanligvis veldig kort fargetid eller overdreven vask. Det korrigeres ved å forlenge kontakttiden med fargestoffet eller redusere vasketiden.

Fargestoff utfelles

Tilstedeværelsen av fargestoffutfelling i smearen kan ha flere årsaker, men de hyppigste årsakene er: bruk av ufiltrert fargestoff, flekker på ujevne fargebroer, bruk ark som er skittent med støv eller fett, ikke vask godt ferdig flekker.

Ekstremt rød eller blå smøre

Bufferen er ansvarlig for fargestoffets pH. Fargestoffer med en pH under den som er angitt (surt) vil resultere i veldig rødlige flekker..

Hvis fargestoffets pH er over (alkalisk), vil det oppnås ekstremt blålig utstryking.

Lagringsmodus

Reagenset skal oppbevares ved romtemperatur.

Referanser

  1. Gutiérrez V. Sammenligningsstudie mellom Wright-fargemetoden og Elisa-testen for diagnose av hundehrlichiose i byen San Pedro Sula, Honduras. 2008. Gradoppgave for å kvalifisere for tittelen veterinærlege. Universitetet i San Carlos i Guatemala.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Grunnleggende flekker i mikrobiologilaboratoriet. Forskning i funksjonshemming. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrights flekk." Wikipedia, The Free Encyclopedia. 18. mai 2018, 12:05 UTC. 8. des 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvens av Babesia spp. på montería hester, Córdoba (Colombia). Pastor udcaaktuell avsløring.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12. utg. Argentina. Redaksjonell Panamericana S.A.
  6. Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health Government of Chile. Anbefalinger for farging av blodutstryk for å lese blodtellingen.

Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.