De DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) Det er et fargestoff som, på grunn av sin fluorescerende egenskap, fungerer som en markør, blant annet brukt i fluorescensmikroskopi eller flowcytometri-teknikk. Fluorescensen den avgir er lyseblå, dens eksitasjon skjer mellom 455-461 nm (UV-lys).
DAPI fargestoff kan passere gjennom cellemembranen til døde celler med stor letthet. Det kan også flekker kjernene til levende celler, men i dette tilfellet må konsentrasjonen av dette være høyere.
Fargestoffet er i stand til å få tilgang til cellulært DNA som det har en spesiell affinitet for, og binder med stor avid til de nitrogenholdige basene adenin og tymin. Av denne grunn er det veldig nyttig i noen molekylærbiologiske teknikker..
Denne forbindelsen tilhører gruppen indolfargestoffer og har vist seg å ha større følsomhet for DNA enn etidiumbromid og propidiumjodid, spesielt på agarosegeler..
Bruken av dette fluorescerende fargestoffet er veldig bredt, da det er nyttig for: å studere endringer i DNA i apoptotiske prosesser (celledød) og derfor oppdage celler i denne prosessen; for DNA-fotavtrykk (DNA-fotoutskrift); å studere bakteriell forurensning; eller å visualisere kjernefysisk segmentering.
Det har også blitt brukt i studien av kromosomale bånd, i påvisning av DNA fra Mycoplasmas sp, i DNA-protein-interaksjon, i farging og telling av celler ved immunfluorescens og til og med å farge modne pollenkorn.
Artikkelindeks
DAPI er en forkortelse for sitt kjemiske navn (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Molekylformelen er C16HfemtenN5. Den har en molekylvekt på 350,3. I nærheten av UV-lysområdet (345 til 358 nm) oppstår den maksimale eksitasjonen av DAPI-DNA-komplekset, mens den maksimale fluorescensemisjonen skjer mellom 455-461 nm..
Dette fargestoffet er preget av å være et gult pulver, men strukturene markert med denne fluoroforen avgir et sterkt blått lys..
Det er en forbindelse løselig i vann, men for å akselerere oppløsningen, kan det påføres noe varme. Den kan fortynnes med PBS, men ikke oppløses direkte i den..
Når fargestoffet er klargjort, må det oppbevares i mørket, det vil si beskyttet mot lys, ved en temperatur på 2 til 8 ° C (kjøleskap). Under disse forholdene er fargestoffet stabilt i mer enn 3 uker eller måneder..
Hvis den er beskyttet mot lys, men får stå ved romtemperatur, synker stabiliteten til 2 eller 3 uker, men utsatt for direkte lys er forverringen veldig rask. Hvis du vil lagre mye lenger, kan den oppbevares i kjøleskap ved -20 ° C fordelt i alikvoter.
Denne fargingen er basert på å generere en kjernefysisk motflekk i de viktigste molekylærbiologiske teknikkene, for eksempel: flowcytometri, fluorescensmikroskopi og farging av metafasekromosomer eller mellomfasekjerner, blant andre..
Denne teknikken er basert på den store affiniteten som fargestoffet har for de nitrogenholdige basene (adenin og tymin) som finnes i genetisk materiale (DNA) i mindre spor. Mens det er på cytoplasmisk nivå, etterlater det veldig lite bakgrunn.
Når det fluorescerende fargestoffet binder seg til adenin- og tyminregionene i DNA, øker fluorescensen betydelig (20 ganger mer). Fargen den avgir er lyseblå. Spesielt er det ingen fluorescensemisjon når binding til GC (guanin-cytosin) basepar.
Det er viktig å merke seg at selv om det også har en affinitet for RNA, forårsaker dette ikke noe problem, fordi den høyeste graden av energiutslipp fra dette molekylet oppstår ved en annen bølgelengde (500 nm), i motsetning til DNA, som gjør det ved 460 nm . I tillegg er økningen i fluorescens når den først er festet til RNA bare 20%..
DAPI brukes mer til å flekker døde (faste) celler enn levende celler, siden det er mye høyere konsentrasjon av fargestoffet som trengs for å flekker sistnevnte, dette er fordi cellemembranen er mye mindre permeabel for DAPI når den er i live.
DAPI-flekk kan brukes i kombinasjon med røde og grønne fluoroforer for en flerfarget opplevelse.
DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) er en utmerket fluorofor og brukes derfor mye i forskjellige teknikker og til forskjellige formål. Bruken av DAPI i hovedteknikkene er forklart nedenfor.
Forskerne Gohde, Schumann og Zante i 1978 var de første til å bruke og foreslå DAPI som fluorofor i strømningscytometri-teknikken, og hadde stor suksess på grunn av dens høye følsomhet for DNA og dens høye intensitet i fluorescensemisjon..
Bruk av DAPI i denne teknikken gjør det mulig å studere cellesyklusen, kvantifisering av celler og farging av levende og døde celler..
Selv om det finnes andre fargestoffer, som etidiumbromid, Hoechst-oksid, akridinorange og propidiumjodid, er DAPI en av de mest brukte fordi den er mer fotostabil enn de som er nevnt tidligere..
For denne teknikken er det nødvendig å fikse cellene, for dette kan absolutt etanol eller 4% paraformaldehyd brukes. Prøven sentrifugeres og supernatanten kastes, deretter blir cellene hydrert ved tilsetning av 5 ml PBS-buffer i 15 minutter..
Mens tiden går, forbered DAPI-flekken med en fargebuffer (FOXP3 fra BioLegend) i en konsentrasjon på 3 uM.
Sentrifuger prøven, kast supernatanten og dekk deretter til med 1 ml DAPI-løsning i 15 minutter ved romtemperatur..
Ta prøven til flowcytometeret med riktig laser.
En annen teknikk der DAPI brukes er i strømningsmikro-fluorometri sammen med en annen fluorofor kalt mitramycin. Begge er nyttige for å kvantifisere kloroplast-DNA individuelt, men DAPI er best egnet for måling av T4-bakteriofagpartikler..
Denne teknikken bruker i utgangspunktet DNA-sonder merket med et fluorescerende fargestoff som kan være DAPI..
Prøven krever varmebehandling for å denaturere dobbeltstrenget DNA og konvertere det til to enkeltstrengede tråder. Deretter hybridiseres den med en denaturert DNA-probe merket med DAPI som har en sekvens av interesse..
Senere vaskes den for å eliminere det som ikke hybridiserte, en kontrast brukes til å visualisere DNA. Fluorescensmikroskopet tillater observasjon av den hybridiserte sonden.
Denne teknikken har til formål å oppdage spesifikke sekvenser i det kromosomale DNAet, og være i stand til å stille diagnosen visse sykdommer..
Disse cytomolekylære teknikkene har vært til stor hjelp for å bestemme detaljer i studiet av karyotyper. For eksempel har det vist regionene som er rike på adenosin- og tyminbasepar kalt heterokromatiske regioner eller DAPI-bånd..
Denne teknikken er mye brukt for å studere kromosomer og kromatin hos planter og dyr, samt til diagnostisering av prenatal og hematologisk patologi hos mennesker..
I denne teknikken er den anbefalte DAPI-konsentrasjonen 150 ng / ml i en periode på 15 minutter..
Monterte lysbilder skal lagres beskyttet mot lys ved 2-8 ° C.
Cellene fikseres med 4% paraformaldehyd. Hvis andre flekker skal brukes, blir DAPI igjen på slutten som en motflekk, og cellene dekkes med PBS-løsning i 15 minutter. Mens tiden går, klargjør du DAPI-løsningen ved å fortynne den med PBS, slik at den endelige konsentrasjonen er 300 uM.
Deretter fjernes overflødig PBS og dekkes med DAPI i 5 minutter. Den vaskes flere ganger. Lysbildet observeres i et fluorescensmikroskop under riktig filter.
Denne forbindelsen må håndteres med forsiktighet, fordi den er en forbindelse som har mutagene egenskaper. Aktivt karbon brukes til å eliminere denne forbindelsen fra vandige løsninger som skal kastes..
Hansker, kjole og vernebriller må brukes for å unngå ulykker med dette reagenset. Hvis hudkontakt eller slimhinne oppstår, bør området vaskes med nok vann.
Du bør aldri pipettere dette reagenset gjennom munnen, bruk pipetter.
Ikke forurens reagenset med mikrobielle midler, da dette vil føre til feilaktige resultater.
Ikke fortynn DAPI-flekken mer enn anbefalt, da dette vil redusere kvaliteten på fargingen betydelig..
Ikke utsett reagenset for direkte lys, eller hold det varmt da dette reduserer fluorescens.
Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.