De restriksjonsenzymer er endonukleaser brukt av visse arkeaer og bakterier for å hemme eller "begrense" spredningen av virus i dem. De er spesielt vanlige i bakterier og er en del av deres forsvarssystem mot fremmed DNA kjent som restriksjon / modifiseringssystem..
Disse enzymene katalyserer spaltingen av dobbeltbånds-DNA på bestemte steder, reproduserbart og uten bruk av ekstra energi. De fleste krever tilstedeværelse av kofaktorer som magnesium eller andre toverdige kationer, selv om noen også krever ATP eller S-adenosylmetionin.
Begrensningsendonukleaser ble oppdaget i 1978 av Daniel Nathans, Arber Werner og Hamilton Smith, som mottok Nobelprisen i medisin for oppdagelsen. Navnet deres kommer vanligvis fra organismen der de først ble observert.
Slike enzymer er mye brukt i utviklingen av DNA-kloningsmetoder og andre molekylærbiologi og gentekniske strategier. Deres spesifikke sekvensgjenkjenningsegenskaper og evnen til å kutte sekvenser nær gjenkjenningsstedene gjør dem til kraftige verktøy i genetisk eksperimentering..
Fragmenter generert av restriksjonsenzymer som har handlet på et bestemt DNA-molekyl kan brukes til å gjenskape et "kart" over det opprinnelige molekylet ved å bruke informasjon om stedene der enzymet kuttet DNA..
Noen restriksjonsenzymer kan ha samme gjenkjenningssted på DNA, men de kutter ikke nødvendigvis det på samme måte. Dermed er det enzymer som kutter og forlater stumpe ender og enzymer som kutter og forlater sammenhengende ender, som har forskjellige anvendelser innen molekylærbiologi..
For tiden er det hundrevis av forskjellige kommersielt tilgjengelige restriksjonsenzymer, som tilbys av forskjellige kommersielle hus; disse enzymene fungerer som "tilpassede" molekylære saks for forskjellige formål.
Artikkelindeks
Restriksjonsenzymer oppfyller den motsatte funksjonen av polymeraser, siden de hydrolyserer eller bryter esterbindingen i fosfodiesterbindingen mellom tilstøtende nukleotider i en nukleotidkjede..
I molekylærbiologi og genteknologi er de mye brukt verktøy for konstruksjon av ekspresjons- og kloningsvektorer, samt for identifisering av spesifikke sekvenser. De er også nyttige for konstruksjon av rekombinante genomer og har et stort bioteknologisk potensial..
Nylige fremskritt innen genterapi bruker nå restriksjonsenzymer for innføring av bestemte gener i vektorer som er bærere for transport av slike gener til levende celler, og som sannsynligvis har evnen til å sette inn i det cellulære genomet for å utføre permanente endringer..
Restriksjonsenzymer kan katalysere dobbeltbånds DNA-spaltning, selv om noen er i stand til å gjenkjenne enkeltbånds DNA-sekvenser og til og med RNA. Klippet skjer etter gjenkjenning av sekvensene.
Virkningsmekanismen består av hydrolyse av fosfodiesterbindingen mellom en fosfatgruppe og en deoksyribose i ryggraden i hver DNA-streng. Mange av enzymene er i stand til å kutte på samme sted som de kjenner igjen, mens andre kutter mellom 5 og 9 basepar før eller etter samme.
Normalt kutter disse enzymene i 5'-enden av fosfatgruppen, noe som gir DNA-fragmenter med en 5'-fosforylende og en 3'-terminal hydroksylende..
Siden proteiner ikke kommer i direkte kontakt med gjenkjenningsstedet i DNA, må de translokeres suksessivt til det spesifikke stedet er oppnådd, kanskje ved hjelp av "glidende" mekanismer på DNA-strengen..
Under enzymatisk spaltning er fosfodiesterbindingen til hver av DNA-strengene plassert innenfor et av de aktive stedene av restriksjonsenzymer. Når enzymet forlater gjenkjennelses- og spaltingsstedet, gjør det det gjennom ikke-spesifikke forbigående assosiasjoner.
Fem typer restriksjonsenzymer er for tiden kjent. Her er en kort beskrivelse av hver enkelt:
Disse enzymene er store pentameriske proteiner med tre underenheter, en for restriksjon, en for metylering og en for sekvensgjenkjenning i DNA. Disse endonukleasene er multifunksjonelle proteiner som er i stand til å katalysere restriksjons- og modifikasjonsreaksjoner, de har ATPase-aktivitet og også DNA-topoisomerase..
Enzymer av denne typen var de første endonukleasene som ble oppdaget, de ble først renset på 1960-tallet og har blitt studert i stor dybde siden.
Type I-enzymer brukes ikke mye som et bioteknologisk verktøy, siden spaltingsstedet kan være i en variabel avstand på opptil 1000 basepar fra gjenkjenningsstedet, noe som gjør dem upålitelige når det gjelder eksperimentell reproduserbarhet..
De er enzymer sammensatt av homodimerer eller tetramerer som kutter DNA på definerte steder mellom 4 og 8 bp i lengde. Disse spaltingsstedene er vanligvis palindromiske, det vil si at de gjenkjenner sekvenser som blir lest på samme måte i begge retninger..
Mange av type II-restriksjonsenzymer i bakterier kutter DNA når de gjenkjenner dets fremmede karakter, siden den ikke har de typiske modifikasjonene som dens eget DNA burde ha.
Dette er de enkleste restriksjonsenzymer siden de ikke krever annen kofaktor enn magnesium (Mg +) for å gjenkjenne og kutte DNA-sekvenser..
Presisjonen til type II-restriksjonsenzymer ved å gjenkjenne og kutte enkle sekvenser i DNA i presise posisjoner gjør dem til en av de mest brukte og uunnværlige i de fleste grener av molekylærbiologi..
Innenfor gruppen av type II restriksjonsenzymer er det flere underklasser klassifisert i henhold til visse egenskaper som er unike for hver enkelt. Klassifiseringen av disse enzymene gjøres ved å legge til bokstaver i alfabetet, fra A til Å etter navnet på enzymet.
Noen av underklassene som er mest kjent for sin nytte er:
De er dimerer av forskjellige underenheter. De gjenkjenner asymmetriske sekvenser og brukes som ideelle forløpere for generering av kutteenzymer.
De består av en eller flere dimerer og kutter DNA på begge sider av gjenkjenningssekvensen. Klipp begge DNA-strengene med et basisparintervall foran gjenkjenningsstedet.
Enzymer av denne typen er polypeptider med funksjoner for deling og modifisering av DNA-tråder. Disse enzymene kutter begge strengene asymmetrisk.
Enzymer i denne underklassen er mest brukt i genteknologi. De har et katalytisk sted og krever generelt en allosterisk effektor. Disse enzymene må samhandle med to kopier av gjenkjenningssekvensen for å utføre effektiv spaltning. Innenfor denne underklassen er enzymene EcoRII og EcoRI.
Type III-restriksjonsendonukleaser består av bare to underenheter, den ene er ansvarlig for DNA-gjenkjenning og modifisering, mens den andre er ansvarlig for sekvensspalting.
Disse enzymene krever to kofaktorer for deres funksjon: ATP og magnesium. Restriksjonsenzymer av denne typen har to asymmetriske gjenkjennelsesseter, translokerer DNA på en ATP-avhengig måte og kutter det mellom 20 og 30 bp ved siden av gjenkjenningsstedet..
Type IV-enzymer er enkle å identifisere siden de kutter DNA med metyleringsmerker, de består av flere forskjellige underenheter som er ansvarlige for å gjenkjenne og kutte DNA-sekvensen. Disse enzymene bruker GTP og divalent magnesium som medfaktorer.
Spesifikke spaltningssteder inkluderer nukleotidstrenger med metylerte eller hydroksymetylerte cytosinrester på en eller begge tråder av nukleinsyrer..
Denne klassifiseringen grupperer enzymene av typen CRISPER-Cas, som identifiserer og kutter spesifikke DNA-sekvenser fra invaderende organismer. Cas-enzymer bruker en syntetisert guide RNA-streng fra CRISPER for å gjenkjenne og angripe invaderende organismer.
Enzymer klassifisert som type V er polypeptider strukturert etter type I, II og II enzymer. De kan kutte seksjoner av DNA fra nesten hvilken som helst organisme og med et bredt spekter av lengde. Deres fleksibilitet og brukervennlighet gjør disse enzymene til et av de mest brukte verktøyene innen genteknologi i dag, sammen med type II-enzymer..
Restriksjonsenzymer har blitt brukt for påvisning av DNA-polymorfier, spesielt i populasjonsgenetiske studier og evolusjonære studier ved bruk av mitokondrie-DNA, for å få informasjon om nukleotidsubstitusjonshastigheter..
For tiden har vektorene som brukes for transformasjon av bakterier for forskjellige formål multikloneringssteder der det er gjenkjennelsesseter for flere restriksjonsenzymer..
Blant disse enzymene er de mest populære EcoRI, II, III, IV og V, oppnådd og beskrevet for første gang fra E coli; HindIII, fra H. influenzae og BamHI fra B. amyloliquefaciens.
Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.