De Löwenstein-Jensen medium er et selektivt fast medium for isolering og utvikling av bakterier av slekten Mycobacterium, som f.eks Mycobacterium tuberculosis, M. avium, blant annet, med unntak av lepraearten, som ikke er dyrkbar.
Bakterier av slekten Mycobacterium vokser ikke i konvensjonelle kulturmedier, derfor var det nødvendig å designe et spesielt medium for deres isolasjon. Det opprinnelige mediet ble opprettet av Löwenstein og senere modifisert av Jensen.
Modifikasjonen besto i eliminering av Kongo-rødfargestoffet, og erstattet den med en høyere konsentrasjon av malakittgrønt. Det endret også konsentrasjonene av magnesiumcitrat og monokaliumfosfat.
Löwenstein-Jensen medium inneholder for øyeblikket potetstivelse, asparagin, magnesiumcitrat, monokaliumfosfat, magnesiumsulfat, malakittgrønn, nalidiksyre, cykloheksimid, lincomycin, pisket egg, glyserin og vann..
Mykobakterier er normalt isolert fra steder som ikke er sterile, for eksempel sputum, urin, abscesser. Dette betyr at de fleste prøvene inneholder den vanlige mikrobiotaen i området, pluss patogenet..
Derfor inneholder Löwenstein-Jensen-mediet en serie inhibitorer i sammensetningen representert av malakittgrønt, antibiotika og soppdrepende midler..
I tillegg må prøver som kommer fra ikke-sterile steder dekontamineres og nøytraliseres før de blir sådd på Löwenstein-Jensen-medium..
Artikkelindeks
Tilstedeværelsen av egg og glyserin i Löwenstein-Jensen-mediet stimulerer veksten av mykobakterier fordi de gir fettsyrene og proteinene som er nødvendige for utviklingen av disse mikroorganismene..
Löwenstein-Jensen-medium inneholder malakittgrønt, som er en hemmer av den medfølgende mikrobiotaen. Men den inneholder også nalidiksyre (35 µg / ml), som hemmer den gramnegative mikrobiota, cykloheksimid (400 µg / ml), som hemmer saprofytisk sopp og gjær, og lincomycin (2 µg / ml), som hemmer den grampositive mikrobiota.
Noen kommersielle selskaper foretrekker å legge til følgende kombinasjon av antibiotika: polymyxin B 200 000 enheter / L, amfotericin B 10 mg / L, karbenicillin 50 mg / L og trimetoprim 10 mg / L.
Dette mediet inneholder ikke agar, derfor skjer størkning av mediet på grunn av koagulering av albuminet som er tilstede i egget under sterilisering..
Vei 37,3 g av det dehydratiserte mediet i 600 ml destillert vann som 12 ml glyserol tidligere er tilsatt. Blandingen varmes opp, omrøres ofte til den er helt oppløst. Autoklaver mediet ved 121 ° C i 15 minutter.
På den annen side bør en homogen suspensjon på 1000 ml ferske egg tilberedes under aseptiske forhold. Tilsett eggesuspensjonen til 600 ml tilberedt medium ved en temperatur på 50 - 60 ° C, og unngå luftbobler.
Antibiotiske løsninger tilsettes også etter autoklavering..
Hell mediet i sterile prøverør med skruelokk. Varm rørene på 85 ° C i 45 minutter i en skråstilling..
Fargen på det tilberedte mediet er akvamaringrønt og kan presentere hvite flekker på grunn av tilstedeværelsen av egglipider..
Mediumets pH må være 7,2 ± 0,2
Oppbevar rørene i kjøleskap og beskyttet mot direkte lys til bruk. Temperer før såing.
Det er en modifisering av mediet kalt "Gruft modification of the Löwenstein Jensen". Dette inneholder de samme forbindelsene som det klassiske mediet, men RNA-5 mg / 100 ml tilsettes, og som hemmere inneholder det malakittgrønt 0,025 g / 100 ml, penicillin 50 U / ml og nalidiksyre 35 ug / ml..
Löwenstein-Jensen medium brukes til isolering av mykobakterier fra forskjellige typer prøver. En Ziehl-Neelsen-flekk anbefales for alle prøver der det er mistanke om tilstedeværelse av mykobakterier..
Noen prøver kommer fra sterile steder, men andre ikke. Ikke-sterile prøver må dekontamineres etter behov:
Sputumprøver skal dekontamineres som følger: Bestem mengden sputumprøve i ml og tilsett samme mengde 4% NaOH til prøven og ruge ved 37 ° C.
Rist blandingen ofte over en periode på 30 minutter. Sentrifuger deretter ved 3000 RPM i 30 minutter.
Kast supernatanten over en fenolisk desinfiserende løsning. Bruk sedimentet til såing, men først må pH nøytraliseres.
For å nøytralisere sedimentet, HtoSW4 5% i nærvær av den fenolrøde indikatoren til den når en nøytral pH som gir en laksefarge.
I dette tilfellet må prøven sentrifugeres ved 3000 RPM i 30 minutter. Supernatanten kastes og pelleten brukes. For å dekontaminere sedimentet, tilsett 3 ml 4% NaOH og rør ofte ved 37 ° C i en periode på en halv time..
Sentrifuger igjen, supernatanten kastes og pelleten brukes. Sistnevnte må nøytraliseres som forklart i sputumprøven..
La prøven legge seg i kjøleskapet i 24 timer. Separer supernatanten. Den gjenværende pelleten skal sentrifugeres i 30 minutter ved 3000 RMP. Kast supernatanten igjen og rekonstituer pelleten med 3 ml steril fysiologisk løsning..
Tilsett 3 ml 4% NaOH og fortsett til dekontaminering og nøytralisering som beskrevet tidligere..
I denne typen prøver sentrifugeres den og supernatanten kastes. Utfør et gram på sedimentet eller observer det direkte under mikroskopet; Hvis ingen bakterier blir observert, er ikke dekontamineringstrinnet nødvendig, og heller ikke nøytraliseringstrinnet.
I dette tilfellet kan prøven sås direkte ved bruk av sedimentet. Hvis det er bakterier, fortsett å dekontaminere og nøytralisere som beskrevet ovenfor..
Til denne typen prøve må 5 ml destillert vann tilsettes til senere sentrifuge ved 1500 o / min i 10 minutter. Kast supernatanten og sentrifuger pelleten ved 3500 RPM i 30 minutter. Bruk sedimentet til å så kulturmediet.
Pinnen skal plasseres i et sterilt rør som inneholder like deler destillert vann og 4% NaOH. Pinnen må presses mot veggene på røret slik at prøven blir fortynnet i væsken. Sentrifuger og bruk sedimentet. Nøytraliser sedimentet som allerede beskrevet.
Löwenstein-Jensen-mediet inokuleres ved å tilsette 0,5 ml av prøven på overflaten av mediet. Roter røret for å distribuere prøven gjennom mediet. Ikke bruk platinahåndtak.
Et annet rør kan sås med Stonebrink-medium for å isolere Mycobacterium bovis og andre arter som ikke vokser i Löwenstein-Jensen-mediet.
De inokulerte rørene inkuberes aerobt ved 37 ° C, med hetten litt løs og tilbøyelig til omtrent 5 ° og beskyttet mot lys. Miljøet kan berikes med 5-10% karbondioksid. Sjekk kulturer to ganger i uken til kolonier vises.
Når prøven er absorbert, strammes hettene. Maksimal inkubasjonstid er 8 uker, hvis det etter denne tiden ikke er vekst, rapporteres det som negativt.
Følgende stammer kan brukes som kvalitetskontroll:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus neoformans ATCC 32045
Det forventes utmerket utvikling for de tre første nevnte artene, for M. fortuitum vekst må være god, mens for M. bovis det forventes liten eller ingen vekst. Mens andre arter enn slekten Mycobacterium må hemmes fullstendig.
Det tilberedte mediet må beskyttes mot lys, langvarig eksponering for lys får mediet til å bli fra grønt til blått. I dette tilfellet kan mediet ikke lenger brukes. Dette er fordi malakittgrønt er lysfølsomt..
Mediet, da det inneholder egg, kan lett forurenses hvis det ikke håndteres aseptisk. Kan oppløses hvis den er forurenset med proteolytiske bakterier.
Dyrking og håndtering av bakterier av slekten Mycobacterium krever kvalifisert personell som er klar over de biosikkerhetstiltakene som må følges for å unngå å bli forurenset eller forurense andre..
HCl bør ikke brukes i nøytraliseringstrinnet på grunn av dannelsen av natriumklorid, som kan være giftig for Kochs basille..
Prøver bør oppbevares nedkjølt og beskyttes mot lys mens de ikke behandles..
Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.