De proteinase K Det er et enzym som tilhører gruppen av serinproteaser, det vil si at det har en aminosyre serin i sitt aktive katalytiske sentrum og har den funksjonen å bryte peptidbindinger ved hydrolyse. I sin tur tilhører dette enzymet familien av subtilisinproteiner (peptidase S8).
Proteinase K har en molekylvekt (MW) på 28.900 dalton og ble isolert for første gang i 1974 i ekstrakter av soppen Engyodontium album, tidligere kjent som Tritirachium album Limber.
Den har en høy proteolytisk kapasitet, demonstrert ved å være i stand til å nedbryte keratinet i håret. Ordet keratin på engelsk er skrevet "keratin", derfor har det blitt kalt "proteinase K".
På grunn av sin høye kraft til å spalte native proteiner, er dette enzymet nyttig i forskjellige molekylærbiologiske teknikker. Brukes hovedsakelig for å isolere og fremstille nukleinsyrer med høy molekylvekt (MW).
Proteinase K fungerer ved å frigjøre nukleært DNA, mens det ødelegger proteiner og inaktiverer RNaser og DNaser, det vil si at det eliminerer nukleaser i DNA og RNA-preparater..
På den annen side har det blitt sett at proteinase K kan hydrolysere noen denaturerte native proteiner, noe som har vekket forskernes interesse for bruk i studiet av prionproteiner (PrPC).
Til tross for deres høye proteolytiske styrke er det imidlertid proteiner som er resistente mot virkningen av proteinase K. Blant dem er noen unormale proteiner kalt prions (PrPSc), assosiert med overførbare spongiforme encefalopatier..
Artikkelindeks
Proteinase K har en tertiær struktur som består av tre lag, med et syvkjedet β-ark plassert mellom to lag med helixer. Fordi den tilhører S8-familien av peptidaser, er den preget av å ha en katalytisk triade i sitt aktive sted, hvis sekvensielle rekkefølge er (Asp, His og Ser), som skiller dem fra andre familier av peptidaser..
Dette enzymet fra gruppen av serinproteaser er preget av hydrolyse av peptidbindinger nær karboksylgruppen av alifatiske og aromatiske aminosyrer..
På den annen side er den i stand til å virke i nærvær av visse etsende stoffer, som natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL og EDTA, som brukes til å hjelpe denaturering av proteiner, noe som får dem til å miste sin opprinnelige struktur ..
Dette er et foreløpig trinn i utarbeidelsen av proteiner for elektroforeseteknikken. PH-området hvor proteinase K virker, er ganske bredt (2,0 til 12,0), med en optimal pH mellom 7,5 og 12,0, og dets isoelektriske punkt er 8,9. Som man kan se, er den aktiv mot et veldig bredt pH-område..
En annen egenskap som skiller seg ut i proteinase K er dens stabilitet i nærvær av høye temperaturer (50 - 60 ° C)..
Proteinase K krever tilstedeværelse av kalsiumion, selv om dette ikke påvirker dets aktivitet, hvis det er viktig for å opprettholde stabiliteten.
For at proteinase K skal fordøye substratet fullt ut, er det nødvendig med en kontakttid på omtrent 5 minutter til 2 timer..
Imidlertid, i denne forstand, Daza et al. Sammenlignet renheten av DNA oppnådd ved forskjellige eksponeringstider mot proteinase K, og konkluderte med at en langvarig inkubasjon (opptil 24 timer) forbedrer kvaliteten på DNA betydelig..
Nå, i forhold til konsentrasjonen av proteinase K-enzymet som brukes i de forskjellige protokollene, kan det sies at det er veldig variert.
Den kan brukes fra svært lave konsentrasjoner (5 µg / ml) til konsentrasjoner på 500 µg / ml. Men de mest hyppige arbeidskonsentrasjonene varierer fra 50-100 μg / ml, spesielt for proteinfordøyelse og nukleaseinaktivering. Selv om det kreves en konsentrasjon på 2 mg / ml for vevsbehandling.
Applikasjonene er veldig brede og kan oppsummeres som følger:
-Den brukes i fordøyelsen av proteiner og DNA-ekstraksjon ved forskjellige metoder som: salting, PK-SDS, cetyl-trimetylammoniumbromid (CTAB), modifisert kaliumacetat og ekstraksjon med natriumjodid..
-Inaktivering av nuklease (RNaser og DNaser).
-I hybridiseringsteknikken in situ (HIS), for å hjelpe frigjøring av nukleinsyrer, i tillegg til å fjerne uønskede proteiner.
-Protein modifikasjon.
-På forskningsnivå, i ulike studier.
Flere sammenlignende studier har blitt utført mellom DNA-ekstraksjonsteknikker som bruker Proteinase K, med andre som ikke bruker det, og alle konkluderer med at det er større fordeler ved bruk av enzymet. Fordelene inkluderer følgende:
-DNA med høy molekylvekt, høy kvalitet og renhet oppnås.
-Det ekstraherte DNA er stabilt i opptil 3 måneder.
Det ekstraherte DNA kan brukes i følgende teknikker: Southern blot, polymerasekjedereaksjon (PCR), elektroforese, blant andre..
Ulike undersøkelser har konkludert med at prioner (unormale toksiske PrPSc-proteiner) skiller seg fra PrPC (native) proteiner ved å være resistente mot virkningen av proteinase K, mens PrPC er følsomme for dens virkning.
Andre forfattere har beskrevet at i strukturen til PrPSc er det følsomme deler og andre motstandsdyktige mot proteinase K. Imidlertid er begge deler like giftige og smittsomme.
På den annen side isolerte Bastian et al. I 1987 isolerte 4 proteiner på 28, 30, 66 og 76 kda fra en art av Spiroplasma mirum. Alle ble funnet å være resistente mot virkningen av proteinase K og hadde også en kryssreaksjon med noen prioner..
Det er kjent at denne arten kan forårsake grå stær og betydelig nevrologisk skade, og på grunn av Bastians vitenskapelige funn, blant andre undersøkelser, har det blitt gjort et forsøk på å koble denne mikroorganismen med overførbare spongiforme encefalopatier..
Imidlertid fortsetter etiologien til denne degenerative nevrologiske patologien å tilskrives prioner i dag..
I denne forstand identifiserte og karakteriserte Butler et al. I 1991 en klasse proteinresistent mot proteinase K på 40 kda fra to stammer av Mycoplasma hyorhinis. Dette patogenet påvirker griser og infiserer vevet, men i dette tilfellet var det ingen kryssreaksjon med de testede prionene..
Mer forskning er nødvendig for å belyse mange ukjente i denne forbindelse.
Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.