De koagulasetest det er en laboratorieteknikk som brukes til å avsløre tilstedeværelsen av koagulaseenzymet. Dette enzymet har egenskapen til å koagulere plasma. Loeb i 1903 var den første som beskrev dette enzymet.
Denne testen er utført på Gram-positive kokker, katalase-positive, slik at man kan skille stammene av Staphylococcus aureus fra resten av stafylokokker, siden det er den eneste mikroorganismen av klinisk betydning som produserer den.
I denne forstand blir medlemmer av Staphylococaceae-familien som tester negativt ofte referert til som koagulase-negativ Staphylococcus..
Det er noen forskjellige belastninger for S. aureus som kan produsere koagulase, for eksempel Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius og S. delphini.
De tre første er imidlertid av klinisk betydning på veterinærnivå og kan svært sjelden bli funnet som et forårsakende middel for infeksjoner hos mennesker, mens S. delphini den finnes bare i marine miljøer.
Videre er de lett differensierte fordi S. hyicus Y S. intermedius ikke gjær mannitol og S. schleiferi spp koagulaner gjærer ikke maltose, heller ikke trehalose, mens S. aureus gjærer disse karbohydratene.
Tilstedeværelsen av koagulaseenzymet har vært knyttet til virulensen til stammene. Imidlertid har denne teorien falt fra hverandre, i lys av det faktum at andre virulente koagulase-negative arter observeres..
Artikkelindeks
Staphylococcus aureus produserer to typer koagulase, en som forblir festet til celleveggen, også kalt agglutinasjonsfaktor eller reaktiv koagulasefaktor (CRF), og en ekstracellulær som frigjøres i flytende kulturer. Derfor kalles de henholdsvis bundet koagulase og fri koagulase..
Koagulaseenzymet skylder navnet til handlingen det produserer. Dette har evnen til å transformere fibrinogen til fibrin, og skape en tydelig blodpropp når den finnes i plasma, det vil si dette enzymet simulerer aktiviteten til trombin i koagulasjonskaskaden..
Faktisk er en av de mest aksepterte teoriene at bundet koagulase reagerer med fri koagulase for å aktivere koagulasjonsfaktorer. Denne aktiveringen genererer et stoff som virker på samme måte som protrombin gjør, og skaper en forbindelse med funksjonen trombin..
Forskjellen med den normale koagulasjonskaskaden er at denne reaksjonen ikke krever tilstedeværelse av kalsium og ikke påvirkes av heparin.
For å utføre koagulasetesten, er det nok å møte en ny kultur av Staphylococcus med et fortrinnsvis kaninplasma og dermed observere dannelsen av koagulasjonen.
Det er spesifikke teknikker for å oppdage bundet koagulase og bundet og fri koagulase samtidig..
Noen stammer av S. aureus de gir et positivt resultat raskere enn andre. Hastigheten for koageldannelse er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av koagulase som er tilstede..
Lysbildekoagulasetesten oppdager bundet koagulase, og rørtesten oppdager både bundet og fri koagulase.
-Rengjør lysbildet
-Kaninplasma, fortrinnsvis humant eller hesteplasma, kan også brukes. Plasma kan kjøpes lyofilisert kommersielt og rekonstitueres for bruk, eller det kan brukes fersk (fersk). Et annet levedyktig alternativ er bruken av fibrinogen.
-Steril saltvann (0,85%) (SSF).
Tegn venøst blod fra mennesker eller dyr. Hvilke som helst av de følgende antikoagulantia kan brukes: EDTA, kalsiumoksalat, heparin eller natriumcitrat. Bland godt og sentrifuger. Fjern supernatanten (plasma) aseptisk uten røde blodlegemer og legg den i et sterilt rør.
Rekonstituer som spesifisert på hetteglasset med kommersielt sett.
Bruk sitrert plasma, bland plasmaet i like deler med en mettet natriumkloridoppløsning. La utfelle og sentrifuger.
Kast supernatanten, rekonstituer bunnfallet opptil 5 ganger volumet med sterilt destillert vann. Tilsett 5 enheter heparin for hver ml fibrinogen. Oppbevares i et sterilt rør.
En dråpe saltløsning og en dråpe plasma plasseres på et lysbilde hver for seg. Ta med platinsløyfen 1 eller 2 rene kolonier av mikroorganismen som skal testes.
Bland bakterielastet i plasmadråpen og gjenta operasjonen på SSF-dråpen. Følg resultatene umiddelbart. Et positivt resultat vil være et der dannelsen av et makroskopisk agglutinat (hvitt bunnfall) observeres etter ett minutt på siden av dråpen med plasma.
SSF-fallet fungerer som en negativ kontroll. Hvis agglutinasjon observeres med SSF, betyr dette at mikroorganismen selvagglutinerer, noe som kan gi falske positive resultater. I dette tilfellet må det bekreftes med rørprøven.
Det anbefales også å montere en positiv kontroll med en kjent belastning på S. aureus.
Agglutinasjon innen 5-20 sek (sterk positiv test).
Variabel agglutinasjon som forekommer mellom 20 sekunder og ett minutt (forsinket positiv test).
En viss grad av agglutinasjon etter ett minutt (tvilsomt bevis). Det anbefales å gjenta testen eller bekrefte med rørmetoden.
Ingen agglutinasjon (negativ test).
Resultat med SSF. Det må alltid gi negativt, hvis det automatisk gir positivt, blir testresultatet ugyldiggjort.
-Sterilt reagensglass
-Plasma
-Vannbad ved 37 ° C.
Pipetter 0,5 ml plasma i et 12 x 75 reagensrør med en steril pipette. Legg platinsløyfen med 2 til 4 rene kolonier for å studere fra en fast kultur i 18 til 24 timer og oppløs i plasma, bland forsiktig og inkuber ved 37 ° C i 4 timer.
Undersøk røret den første timen uten å riste på det, bare vipp det forsiktig. Hvis en blodpropp fremdeles ikke blir sett, kan den observeres hvert 30. minutt til de 4 timene er fullført. Hvis det fremdeles er negativt etter 4 timer, kan det stå i opptil 24 timer, men ved romtemperatur. Observer og rapporter resultatet.
Basert på erfaring, anbefaler noen mikrobiologer å bruke 500 ul av en bakteriesuspensjon fra en 18-timers kultur i flytende medium for å utføre testen..
Det ser ut til å gi raskere og mer pålitelige resultater enn ved emulgering av kolonier fra faste medier, spesielt hvis humant plasma hentet fra blodbanken har blitt brukt..
Bruken av stammer fra en buljong hjelper til med å fortynne den mulige tilstedeværelsen av humane antistylokokkantistoffer i plasma som kan hemme virkningen av koagulase..
Hvis det er sett en blodpropp som omfatter hele væsken (fullstendig koagulering) eller koagulerer uten noe i den gjenværende væsken (delvis koagulering), bør det betraktes som en positiv test..
Hvis det ikke dannes blodpropp, det vil si at suspensjonen forblir homogen, er testen negativ.
Fibrinogen brukes på samme måte som plasma og brukes til både lys- og rørprøver. Fortsett som beskrevet for plasma og tolk på samme måte.
Den brukes til å skille mellom Staphylococcus aureus av koagulase-negative stafylokokker.
Ha friske kulturer av en stamme av S. aureus skal brukes som en positiv kontroll. En stamme av S. epidermidis som negativ kontroll.
-En positiv test skal ikke legges i inkubasjon i 24 timer, da S. aureus produserer et fibrinolysin som løser opp koagelen.
-For en pålitelig test bør fersk eller nylig rekonstituert plasma brukes, i tillegg til at det er viktig å bruke friske bakteriekulturer (18 til 24 timer). Dette unngår falske negativer.
-Testen må utføres i forbindelse med en negativ og en positiv kontroll.
-Noen faste medier kan forstyrre koagulasetesten. Det anbefales ikke å bruke kolonier fra salt mannitolagar.
-Hvis det brukes sitrert plasma, anbefales det å plassere 5 enheter heparin per ml plasma for å unngå falske positive. Dette er fordi noen andre mikroorganismer enn S. aureus de kan bryte ned sitrat og få plasma til å koagulere. I dette tilfellet anbefales det å gjøre en Gram og en katalasetest..
-Det er viktig i rørprøven å overvåke reaksjonen hvert 30. minutt, da det er stammer av S. aureus De produserer høye konsentrasjoner av fibrinolysin og vil fortynne den nydannede blodproppen raskt. Unngå falske negativer.
-Unngå å riste røret kraftig når du overvåker testen, dette kan ødelegge initieringen av blodproppdannelse som ikke vil bli gjenopprettet senere, og forårsake falske negativer.
Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.