Urea buljongfundament, tilberedning og bruk

3674
David Holt

De urea buljong Det er et flytende dyrkningsmedium som brukes til å vise tilstedeværelsen av enzymet urease i visse mikroorganismer. Ureas er et mikrobielt enzym som produseres på en konstitutiv måte, det vil si at det syntetiseres uansett om substratet det virker på er til stede..

Funksjonen til urease er relatert til spaltning av organiske forbindelser. Ikke alle mikroorganismer er i stand til å syntetisere dette enzymet, og dets bestemmelse i laboratoriet gjør det mulig å identifisere visse bakteriestammer og til og med skille mellom arter av samme slekt..

Negativ og positiv ureaprøve. Kilde: Foto tatt av forfatteren MSc. Marielsa gil.

Det er to typer urea-test: Stuart og Christensen. De er forskjellige i sammensetning og følsomhet. Den første er spesiell for å vise en stor mengde urease produsert av arter av slekten Proteus.

Den andre er mer følsom og kan oppdage små mengder urease generert sent av andre bakterieslakter, som Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter og Mycobacterium.

Stuarts ureabuljong består av urea, natriumklorid, dikaliumfosfat, monokaliumfosfat, gjærekstrakt, fenolrødt og destillert vann.

I mellomtiden består Christensens ureabuljong eller agar av peptoner, natriumklorid, monokaliumfosfat, glukose, urea, fenolrødt, destillert vann og agar-agar. Sistnevnte bare hvis det er det faste mediet.

Artikkelindeks

  • 1 Begrunnelse
    • 1.1 Stuarts ureabuljong
    • 1.2 Christensens Urea Agar eller buljong
    • 1.3 Tolkning av begge medier (Stuart og Christensen)
  • 2 Klargjøring
    • 2.1 Stuarts ureabuljong
    • 2.2 Christensens ureaagar eller buljong
  • 3 bruksområder
  • Såing av ureaprøven
  • 5 Kvalitetskontroll
  • 6 Referanser

Basis

Enzymet urease hydrolyserer urea for å danne karbondioksid, vann og to ammoniakkmolekyler. Disse forbindelsene reagerer for å danne det endelige produktet kalt ammoniumkarbonat..

Stuarts ureabuljong

Stuarts ureabuljong er mer bufret med en pH på 6,8. Derfor må mikroorganismen kunne danne store mengder ammoniakk for å bli fenolrød. PH skal stige over 8.

Derfor er Stuarts ureabuljong selektiv for Proteus-arter, noe som gir positive resultater innen 24 til 48 timer etter inkubasjon, og den er ikke effektiv for bakterier som produserer lave mengder urease eller som sakte hydrolyserer urea..

Dette er fordi Proteus-arter er i stand til å bruke urea som nitrogenkilde. I stedet trenger andre urease-produserende bakterier en ekstra kilde.

Pérez et al. (2002) bestemte at Stuarts ureabuljong var like effektiv som Christensens ureaagar, for å bestemme urease i gjærstammer av slektene Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon og Saccharomyces.

Studieforfatterne hevder å ha oppnådd 100% enighet med begge media (Stuart og Christensen) når de inkuberte i 24 og 48 timer; med unntak av at stammene som klarte å gjøre media til en sterk rosa-fuchsia-farge, ble tatt som positive.

Denne avklaringen er nødvendig, siden Lodder (1970) uttalte at nesten alle gjær klarer å gjøre skråningen av Christensens ureaagar til blekrosa. Dette skyldes at de kan hydrolysere urea i små mengder, og på grunn av dannelsen av aminer ved oksidativ dekarboksylering av aminosyrene på overflaten. Dette skal ikke tolkes som positivt.

Christensens ureaagar eller buljong

Christensens ureabuljong eller agar er mindre bufret, og kan oppdage små mengder ammoniakk. Videre er dette mediet beriket med peptoner og glukose. Disse forbindelsene får andre urease-produserende mikroorganismer til å vokse som ikke vokser i Stuart-buljong..

På samme måte gir Christensen urea-test raskere resultater, spesielt for Proteus, å kunne gi sterkt positivt på bare 30 minutter som minimumstid og opptil 6 timer som maksimal tid.

Resten av urease-produserende mikroorganismer klarer å snu fargen på mediet litt etter 6 timer, og sterkt etter 24, 48, 72 timer eller mer, og til og med noen stammer kan gi svake reaksjoner etter 5 eller 6 dager.

Tolkning av begge media (Stuart og Christensen)

Mediet er opprinnelig gul-oransje i fargen, og en positiv reaksjon vil gjøre fargen på mediet til rosa-fuchsia. Intensiteten til fargen er direkte proporsjonal med mengden ammoniakk som produseres.

En negativ reaksjon vil etterlate mediet med den opprinnelige fargen, med unntak av gjær, som kan bli blekrosa på Christensens ureaagarmedium..

Forberedelse

Stuarts ureabuljong

Vei nødvendige gram i henhold til indikasjonene fra det kommersielle selskapet. Oppløs i fortrinnsvis sterilt destillert vann. Ikke bruk varme for å løse seg opp, da urea er følsom for varme.

Membranfiltreringsmetode brukes til å sterilisere. For dette brukes et Millipore-filter med porer med en diameter på 0,45 µ. Ikke bruk autoklav. Når løsningen er filtrert, fordeles den i sterile rør. For å oppnå pålitelige resultater, bør den overføres mellom 1,5 ml som en minimumsmengde og 3 ml som en maksimal mengde per rør..

Oppbevares i kjøleskap og varmes opp før bruk..

Hvis filtreringsmetoden ikke er tilgjengelig, bør mediet brukes umiddelbart for pålitelige resultater..

En annen måte å forberede Stuarts ureabuljong på er som følger:

Noen kommersielle hus selger basismediet for urea-testen, inkludert urea..

Mengden som er angitt av det kommersielle selskapet, veies. Den oppløses i destillert vann og steriliseres i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. La det hvile litt, og tilsett 100 ml av en ureaoppløsning tilberedt med 20% og sterilisert ved filtrering når mediet er varmt..

Den distribueres i sterile rør, som tidligere beskrevet.

Christensens ureaagar eller buljong

-Klargjøring av ureaoppløsningen

Vei ut 29 g dehydrert urea og oppløs i 100 ml destillert vann. Bruk filtreringsmetoden til å sterilisere. Ikke autoklaver.

-Urea base agar

Oppløs 24 g av dehydrert base-agar i 950 ml destillert vann. Steriliser i autoklaven ved 121 ° C i 15 minutter. La stå til den når en temperatur på 50 ° C og tilsett den tidligere tilberedte ureaen aseptisk.

Hell 4 til 5 ml i sterile rør og vipp til de er faste. Det skal være et langt fløytenebb.

Dette mediet kan også fremstilles i flytende form.

applikasjoner

Urea-testen er ekstremt effektiv til å skille slekten Proteus fra andre slekter i familien Enterobacteriaceae, gitt den raske reaksjonen som Proteus gir..

Ved hjelp av Christensen-sammensetningen hjelper testen til å skille mellom arter av samme slekt. For eksempel, S. haemolyticus og S. warneri s Staphylococcus koagulase negativ og beta-hemolytisk, men de er forskjellige i det S. haemolyticus er urea negativ og S. warneri er urea-positiv.

På den annen side brukte McNulty med hell Christensens 2% urea-buljong for å studere tilstedeværelsen av Helicobacter pylori i biopsiprøver tatt fra mageslimhinnen (antral region).

Nærværet av H. pylori det fremgår av en positiv urea-test. Varigheten for å observere resultatene er direkte proporsjonal med mengden av tilstedeværende mikroorganismer.

Som man kan se, er det en enkel metode for diagnostisering av Helicobacter pylori i gastriske biopsier.

Til slutt er denne testen også nyttig for å skille mellom arter av Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus og Mycobacteria..

Såing av ureaprøven

Begge metodene krever et sterkt mikrobielt inokulum for å optimalisere resultatene. Bakteriekolonier er fortrinnsvis hentet fra blodagar og gjær fra Sabouraud agar, med noen få unntak. Inokulatet emulgeres i det flytende mediet.

For Stuarts urea-buljong, ruge ved 37 ° C i 24 til 48 timer, vel vitende om at du bare leter etter stammer av slekten Proteus når stammen er en bakterie. For gjær kan den inkuberes ved 37 ° C eller ved romtemperatur i 24 til 48 timers inkubasjon.

Når det gjelder Christensens ureabuljong, inkuberes den ved 37 ° C i 24 timer. Hvis testen er negativ, kan den inkuberes i opptil 6 dager. Hvis testen er positiv før 6 timer, indikerer det at det er en stamme av slekten Proteus.

Når det gjelder Christensens ureaagar, inokuleres fasingen av agaren sterkt, uten å punktere. Kjøttkraft inkuberes og tolkes på samme måte.

QA

Kontrollstammer som Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 og Salmonella typhimurium.  De to første skal gi positive resultater og de to siste negative resultatene..

Kilde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana S.A. Argentina.

Referanser

  1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Bruk av Stuarts ureabuljong til ureasetesten, som en test i diagnosen gjær. Pastor Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Tilgjengelig på: Scielo.org.
  2. Mac Faddin J. (2003). Biokjemiske tester for identifisering av bakterier av klinisk betydning. 3. utg. Redaksjonell Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott mikrobiologisk diagnose. 12. utg. Redaksjonell Panamericana S.A. Argentina.
  4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologisk diagnose. 5. utg. Redaksjonell Panamericana S.A. Argentina.

Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.