De oksidasetest Det er en diagnostisk metode som viser tilstedeværelsen av enzymkomplekset kalt cytokromoksidase c. Dette systemet induserer transformasjonen av cytokrom redusert til oksidert, siden det fanger oksygen og dette igjen fungerer som den siste elektronakseptoren (H+) i luftveiene.
Begrepet oksidase er en kortfattet måte å referere til enzymet cytokromoksidase, også kjent som indofenoloksidase. I gamle tider ble det antatt at enzymene cytokromoksidase og indofenoloksidase var to forskjellige enzymer, men i dag er de kjent for å være de samme.
For sin del er cytokromer hemoproteiner som inneholder jern og fullfører cytokromoksidasesystemet. Cytokromer kan variere fra art til art.
Det er forskjellige varianter av cytokromer (cytokromer a1, a2, a3 og 0). Noen bakterier kan bare produsere en, men andre opptil to eller tre om gangen. I denne forstand er tilstedeværelsen av cytokrom a og a3 kjent som cytokrom oksidase c. Dette er typen cytokrom som oksidasetesten oppdager..
Slektene Neisseria og Pseudomonas inneholder cytokromoksidase c. Disse slektene gir den positive oksidasetesten, og hjelper til med å skille dem fra slektene henholdsvis Acinetobacter og Stenotrophomonas..
Det er også andre slekter som er oksidase-positive.
Artikkelindeks
Cytokromoksidase c-systemet fungerer som følger: oksidase-positive mikroorganismer bruker oksygen til å generere energi gjennom aerob respirasjon. Dette systemet fungerer takket være transport av elektroner fra donorstoffer som NADH+ mot reseptorstoffer, i dette tilfellet oksygen.
Dette resulterer i produksjon av energi (ATP) og vann eller hydrogenperoksid, avhengig av cytokromoksidasesystemet som mikroorganismen har..
Derfor er de fleste oksidasepositive bakterier også katalasepositive, en nødvendig forutsetning for å eliminere hydrogenperoksyd som produseres, siden dette stoffet er giftig for bakterier..
Cytokromoksidase c-systemet er tilstede i noen aerobe bakterier, noen fakultative anaerober, få mikroaerofile og ingen strenge anaerober. Sistnevnte er forståelig, siden strenge anaerober ikke kan leve i nærvær av oksygen, derfor mangler de cytokromoksidasesystemet..
I denne testen bruker den stoffer som fungerer som kunstige elektronakseptorer, og erstatter naturlige i elektrontransportkjeden..
Det brukes hovedsakelig fargestoffer som parafenylendiamin og indofenol, som fungerer som reseptorsubstrater og kunstige elektrondonorer.
Parafenylendiamin oksyderes av cytokrom oksidase c-systemet. Fargestoffet i redusert form er fargeløst, men i oksidert form er det farget.
Slik påvises tilstedeværelsen av cytokromoksydase c-systemet; siden en positiv reaksjon vil generere en lavendel eller blå-lilla farge avhengig av reagenset som brukes.
På den annen side, hvis den siste elektronakseptante substansen i luftveiskjeden er forskjellig fra oksygen, vil oksidasetesten være negativ (det er ingen fargeproduksjon); dette er tilfellet med anaerobe mikroorganismer.
På samme måte, hvis cytokromet som brukes av mikroorganismen er forskjellig fra cytokromoksidase c, vil det også gi den negative testen..
Det finnes forskjellige reagenser og protokoller for oksidasetesten, alt for samme formål..
Kovacs reagens, Gordon og McLeod reagens, Nadi reagens, Carpenter, Suhrland og Morrison reagens, og bruk av oksidaseskiver.
Den består av 1% tetrametyl-p-fenylendiamindihydroklorid.
Kovacs-reagenset fremstilles ved å oppløse 1 g av den nevnte substansen i 50 ml destillert vann. Den oppvarmes subtilt til den er helt oppløst. Overfør til en gul flaske med tilstrekkelig kapasitet og fyll opp volumet til 100 ml med destillert vann. Vent minst 15 minutter før bruk. Oppbevares i kjøleskap beskyttet mot lys.
Det er merket Kovacs oxidase reagens, for å skille det fra Kovacs reagenset som ble brukt til å avsløre indolprøven. Dette reagenset er det mest følsomme, mindre giftige, men dyrere enn resten av reagensene.
En positiv reaksjon vil påvises med dette reagenset med kolonifargeskiftet til lavendel, som raskt blir lilla nesten svart. En negativ reaksjon er tydelig fordi det ikke er noen fargeendring i kolonien, eller den får en liten rosa farge. Mediet kan også bli mørkere, men det betyr ikke en positiv reaksjon.
Med dette reagenset er reaksjonstiden avgjørende, en fargeendring som skjer mellom 5 og 15 sekunder regnes som en positiv reaksjon..
Den består av dimetyl-p-fenylendiamindihydroklorid, også kjent som N-dimetyl-p-fenylendiamin eller p-aminodimetylanilinmonohydroklorid. Den fremstilles som beskrevet for Kovacs oksidasereagens, og erstatter stoffet som er involvert..
Dette reagenset er litt mer stabilt enn Kovacs oxidase-reagens, selv om alle reagenser som inneholder p-fenylendiamin er ustabile..
Denne reaksjonen blir senere tolket som positiv med utseendet til en blå-lilla farge innen 10 til 30 minutter..
Den består av 1% α-naftol i etylalkohol (95% etanol) og 1% aminodimetylanilin. Blandingen fremstilles i like store deler og bruker absolutt etylalkohol som et fortynningsmiddel, til den tilstrekkelige mengden er fullført til 100 ml.
Den består av 1% p-aminodimetylalaninoksalat. Forbered på samme måte som beskrevet for Kovacs oksidasereagens, og bytt for det tilsvarende stoffet.
Når løsningen er klar, klargjør du teststrimler som følger: 6-8 cm Whatman nr. 1 filterpapirstrimler er impregnert med 1% dimetyl-p-fenylendiaminoksalatreagens.
De får tørke uten kontakt med metall, oppbevares i skrutrekkede glass med tørkemiddel og oppbevares i kjøleskapet. Disse stripene er stabile i opptil 6 måneder.
Det er det mest stabile reagenset av alle de nevnte, og kan vare opptil 6 måneder i oppløsning. Et annet plusspoeng er at den ikke fargelegger mediet rundt kolonien, hvis det brukes direkte på platen.
Utseendet til en rød farge tolkes som en positiv test.
De er kommersielle plater som er impregnert med reagens for oksidasetesten. Det er flere kommersielle merker på markedet.
Bruken av den er ganske praktisk, siden det ikke er nødvendig å tilberede ferske reagenser, noe som letter arbeidet. De oppnådde resultatene er pålitelige så lenge platene er riktig bevart.
Direkte platemetode, indirekte metode på papir og bruk av plater impregnert med oksidasereagenser.
2 eller 3 dråper av hvilke som helst av de nevnte reagensene tilsettes for dette formålet direkte på kolonien / koloniene inneholdt i en plate med dyrkningsmedium som ikke inneholder glukose..
Forandringen eller ikke fargen på koloniene tolkes, ikke på mediet. Den gyldige reaksjonstiden avhenger av reagenset som brukes.
Skjær et stykke filterpapir (Whatman nr. 1) til en størrelse på 6 cmto og plassert i en tom petriskål.
Tilsett 2 eller 3 dråper av Kovacs oksidasereagens på papiret, ta en del av kolonien som skal studeres med et platinahåndtak eller tre-tannpirker og spre den i en rett linje på det reagensimpregnerte papiret. Utfør innen 5-10 sekunder.
Med stripene tilberedt med Carpenter, Suhrland og Morrison reagens, blir en koloni spredt på den tørre stripen. En enkelt stripe brukes til å teste flere stammer. Tolk på 10 sek.
Fukt kommersielle skiver subtilt med sterilt destillert vann og legg på kolonien som skal studeres. Det anbefales å bruke platene ved 35 ° C. Hvis platene ved romtemperatur eller kjøleplater brukes, er reaksjonen litt tregere. Tolke fargeskiftet mellom 10 og 20 sek.
Kolonier i blod eller sjokoladeagar kan brukes.
Fukt disken som beskrevet tidligere. Legg den i en tom petriskål. Ta en tilstrekkelig mengde av kolonien for å studere med et platinahåndtak eller en tannpirker av tre og legg på disken. Tolke fargeskiftet mellom 10 og 20 sek.
Slekten Neisseria og Acinetobacter er noen ganger veldig like morfologisk fordi selv om slekten Acinetobacter er en gramnegativ stang, kan den noen ganger ta en koksoidform og distribueres parvis, og simulere slekten Neisseria..
I dette tilfellet er oksidasetesten veldig nyttig. Slekten Neisseria er positiv og Acinetobacter negativ.
Imidlertid er slekten Moraxella veldig lik slekten Neisseria, og begge gir en positiv reaksjon; det er grunnen til at karbohydratgjæringstester alltid må utføres for definitiv identifikasjon.
På den annen side er oksidasetesten nyttig for å skille en bakterie som tilhører Enterobacteriaceae-familien (alle oksidase-negative) fra andre gjærere, som slekten Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oksidase-positiv).
Slekten Vibrio og Helicobacter er også oksidase-positive.
Bruk kjente stammer av Escherichia coli som en negativ kontroll og belastninger av Pseudomonas aeruginosa som en positiv kontroll.
-Reagensene må brukes nylaget, holdbarheten i oppløsning ved romtemperatur er kort fordi de er veldig ustabile. Nedkjølt kan de vare mellom 5 dager og 2 uker.
-Reagensene er fargeløse, hvis de endrer farge, må de kastes. Skadede plater er tydelige fordi de mørkner over tid.
-En positiv reaksjon med Kovacs oksidasereagens mellom 15-60 sek regnes som en forsinket reaksjon, og etter 60 sekunder bør den betraktes som negativ.
-De Haemophylus influenzae gir en negativ oksidasereaksjon hvis noe reagens med dimetyl-p-fenylendiamin brukes, men positivt hvis Kovacs oksidasereagens (tetrametyl-p-fenylendiamin) brukes.
-Medier som inneholder glukose forstyrrer testen og gir falske negativer.
-Stammer av Bordetella pertussis kan gi en falsk positiv reaksjon hvis de kommer fra høykonsentrerte blodagarplater.
-Bruken av metall (jern) håndtak gir en falsk positiv reaksjon.
-Siden reagensene er veldig ustabile og har en tendens til å oksidere seg selv, anbefales det å fryse alikvoter på 1 til 2 ml og fjerne etter behov..
-En annen måte å forsinke automatisk oksydasjon av reagenset er å tilsette 0,1% askorbinsyre når reagensene fremstilles..
-Ettersom reagensene er ustabile, anbefales en ukentlig kvalitetskontroll..
-Reagenser som ikke klarer kvalitetskontrolltesten, bør ikke brukes..
Ingen har kommentert denne artikkelen ennå.